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在研发抗体展示平台的过程中，特别是在与学生一起工作的过程中，著者深刻体会到实验技巧对实验成功的重要性。许多时候，实验进展缓慢并不是因为实验设计或实验思路不对，而是因为实验方法不对、实验技巧欠缺或实验结果的分析方法不对。这不但影响研发的进展，也影响学生和科研新手的科研兴趣，甚至可能影响职业选择和职业发展。为解决这个困难，作者撰写了该书。

目? 录

引言 001

章? 建立哺乳动物细胞表面抗体展示技术平台 002

节? 多样化的抗体筛选技术 002

一、杂交瘤技术 004

二、B 淋巴细胞单克隆技术 005

三、细胞表面抗体展示技术 005

四、哺乳动物细胞表面全长抗体展示技术 006

第二节? 全长抗体在哺乳动物细胞表面的展示和分析 008

一、单基因表达系统的选择 008

二、分泌型全长抗体的表达和分析 009

三、展示型全长抗体的表达和分析 012

四、抗原与展示型抗体的结合具有剂量依赖性 026

第三节? 同步表达展示型和分泌型抗体 028

一、FCS（Furin 切割序列） 028

二、表达载体的设计和构建 029

三、抗体表达细胞 030

四、展示型抗体的分析 032

五、分泌型抗体的分析 033

第二章? 哺乳动物细胞表面抗体展示技术平台的应用 038

节? 筛选抗原特异性抗体 038

第二节? 分析不同抗体的表达强度 040

一、抗体的选择 040

二、具体的实验和分析过程 040

第三节? 筛选高亲和力抗体 045

第四节? 分析鉴定中和抗体 054

第三章? 应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术优化抗体亲和力 058

节? 随机突变展示型抗体基因库的构建及分析 058

一、抗体及突变位点的选择 058

二、突变方案及引物设计 060

三、抗体基因库的构建及分析 060

第二节? 细胞水平抗体库的构建及高中和活性抗体的筛选 063

一、细胞库的构建及分析 063

二、阳性抗体克隆的分选与分析 064

三、阳性抗体突变位点氨基酸的变化与中和活性的提高 065

第四章? 展示型全长人源一级抗体库的构建及分析 067

节? 表达载体的构建 068

一、启动子的选择 068

二、限制性内切酶的选择 068

第二节? 抗体基因库的扩增 078

一、基本思路 078

二、设计合成扩增引物 080

三、外周血淋巴细胞总 RNA 提取 084

四、基因库 cDNA 链的合成 085

第三节? 抗体库的常规构建 091

第四节? 抗体库的快速构建 100

人源抗体重链可变区和全长轻链基因扩增引物的分组 100

第五章? 定向快速高效多片段分子克隆与二级抗体库的构建 114

节? 需求与可行性 114

第二节? 双表达载体的设计与构建 116

一、双表达载体需要的功能组分 116

二、双表达载体的设计 117

三、引物的设计及 DNA 片段的 PCR 合成 118

四、4 片段定向连接构建双表达载体 119

五、分析双表达载体的抗体表达功能 120

六、4 个片段的自我连接与定向连接分析 121

七、4 片段定向连接效率分析 123

第三节? 用 4 片段定向连接快速高效构建二级抗体库 124

第六章? 乙型肝炎病毒表面抗原特异性抗体的筛选 126

节? 从抗体库筛选特异性抗体的思路 126

一、一级抗体库的特点及筛选难度 126

二、二级抗体库与定点整合系统的局限性 127

三、从细胞展示抗体库中筛选特异性抗体的设想 128

四、从定点整合二级免疫抗体库开始是一个可行的方案 129

第二节? 乙型肝炎特异性一级库的构建及分析 129

一、为什么选择筛选乙型肝炎病毒表面抗原特异性抗体 129

二、PBMC 的需求及总 RNA 的提取 131

三、一级抗体库的库容及质量分析 131

第三节? 双表达定点整合乙型肝炎特异性抗体库的构建及分析 134

一、载体水平定点整合乙型肝炎特异性抗体库的库容及质量分析 134

二、定点整合抗体稳定表达细胞库的构建及质量分析 136

三、稳定表达细胞库的质量分析及保存 137

第四节? 乙型肝炎表面抗原特异性抗体的筛选与鉴定 139

一、抗原的确定和处理 139

二、表达抗 HBsAg 抗体细胞的富集 143

三、表达抗 HBsAg 抗体单细胞克隆的分析鉴定 146

第七章? 实战技巧专题讨论 153

节? 分子生物学研究实验材料的特点及操作技巧 153

一、DNA 与 PCR 154

二、RNA 与基因克隆 158

三、蛋白质的稳定性及其变性 160

四、几种特殊情况下的实用技巧 161

第二节? 影响小提 RNA 质量和产量的因素 167

一、RNA 酶与 RNA 的质量产量 167

二、总 RNA 小提技巧 171

第三节? 质粒 DNA 的提取与鉴定 174

一、影响小提质粒 DNA 产量质量的因素 174

二、质粒 DNA 小提技巧 179

三、阳性细菌克隆的筛选 184

四、质粒 DNA 中提实例 190

第四节? 琼脂糖凝胶电泳操作技巧 200

一、DNA 琼脂糖凝胶电泳的考虑因素 201

二、DNA 琼脂糖凝胶电泳操作技巧 205

三、实例分析：用一块凝胶同步分析从 0.5kb 到 10kb 的 DNA 片段 216

第五节? 抗体库的构建与分析 218

一、构建大容量抗体基因库需要考虑的因素 219

二、抗体库轻重链的配对分析与保存 229

三、抗体稳定表达细胞库的构建、染色、分析和分选 233

第六节? 细胞生物学研究实验材料的特点及操作技巧 237

一、细胞的培养与传代 238

二、细胞的冻存与复苏 242

参考文献 246

周辰，1978年广州 军医大学军医系毕业。1983年西安第四军医大学,生物化学专业硕士。1995年西安第四军医大学,分子生物学专业博士。曾任美国南加州大学附属儿童医院免疫和骨髓移植系研究员、美国加州圣地亚哥Immusol生物公司 研究员、南方医科大学客座教授/特聘教授，双展生物(贺州)科技有限公司联合创始人、总经理。细胞周期与基因表达调控、抗艾滋病基因治疗药物的研发、抗血栓抗体新药的研发等方面取得显著进展，发表论文22篇、出版著作3部，获得专利3项。

  杨于军，1974-1978：南方医科大学（ 军医大学）医学博士，1989-1992：美国南加州大学附属儿童医院血液-肿瘤系博士后。先后任美国南加州大学附属儿童医院血液-肿瘤系博士后研究员、美国南加州大学附属儿童医院免疫和血液肿瘤系研究专员-III、实验室经理，美国斯坦福大学儿童医院儿科系造血干细胞血液-骨髓移植系生命科学研究专员，泷搌（上海）生物科技有限公司研发部 经理。

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科学家研究自然，并非因为它有用处；他研究它，是因为他喜欢它，他之所以喜欢它，是因为它是美的。如果自然不美，它就不值得了解；如果自然不值得了解，生命也就不值得活着。当然，我在这里所说的没，不是打动感官的美，也不是质地美和外观美；并非我小看这样的 没，完全不是，而是它与科学无关；我意指那种比较深奥的没，这种没来自各部分的和谐秩序，并且纯粹的离职能够把握它。正是这种美给与物体，也可以说是给与结构以让我们的感官满意的彩虹般的外观，而没有这种支持，这些倏忽即逝的梦幻之美只能是不完美的，因为它是模糊的，纵使短暂的。相反的，离职美可以充分达到其自身，科学家之所以投身于长期而艰巨的劳动，也许为理智美甚于为人类未来的福利。

正因为简单是美的，正因为宏伟是美的，所以我们宁可寻求简单的事实、崇高的事实；我们时而乐于追寻星球的雄伟路线；我们时而乐于用显微镜观察极其微小的东西，这也是一种宏伟；我们乐于在地质时代寻找过去的痕迹，它之所以吸引人，是因为它年代久远。

But scientists believe that there is a hierarchy of facts, and that a judicious selection can be made. They are right, for otherwise there would be no science, and science does exist...

This shows us how our selection should be made. The most interesting facts are those which can be used several times, those which have a chance of recurring. We have been fortunate enough to be born in a world where there are such facts. Suppose that instead of eighty chemical elements we had eighty millions, and that they were not some common and others rare, but uniformly distributed. Then each time we picked up a new pebble there would be a strong probability that it was composed of some unknown substance. Nothing that we knew of other pebbles would tell us anything about it. Before each new object we sh...

科学家研究自然，并非因为它有用处；他研究它，是因为他喜欢它，他之所以喜欢它，是因为它是美的。如果意思自然不美，它就不值得了解；如果自然不值得的了解，生命也就不值得活着。当然，我在这里所说的美，不是打动感官的美，也不是质地美和外观美；并非我小看这样的美，完全不是，而是它与科学无关；我意指那种比较深奥的美，这种美来自各部分的和谐秩序，并且纯粹的理智能够把握它。

或者这种简单性是真实的，或者要素密切地混合起来，以至于无法区分。在第一种情况下，存在我们重新遇到这个同一简单事实的机遇，无论它在整体上是纯粹的，还是它本身作为要素进入复杂的复合体中。在第二种情况下，这种密切的混合同样比异质的集合复现的机遇更多；机遇知道如何混合，而不知道如何分解，不知道如何用许多要素建造秩序井然的大厦，在这个大厦内，某些事物可以区分，但必须特意做成。因此，看来仿佛是简单的事实——即使它们并非如此——将更容易被机遇恢复。正是这一点可以为科学家本能地采取的方法辩护，进一步为它辩护的也许是，经常复现的事实对我们来说似乎是简单的，恰恰因为我们经常用到它们。

而社会学家却大为困惑；对他来说，要素是人，这太不相似了，太变幻莫测了，太反复无常了，一言以蔽之，太复杂了；此外，历史从来也不会重演。那么，如何选择有趣的、可以重演的事实呢？方法恰恰在于事实的选择；于是，首先需要着手创造方法，并且已想像出许多，由于没有一个方法会硬充方法，于是社会学是方法最多而结果最少的科学。

科学的作用在于生产思维经济，就像是机器生产劳动经济一样……于是，事实的重要性用它产生的效益来衡量，也就是说，用它容许我们节省的思维数量来衡量。

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